Diagnostyka pasożytów jelitowych metodą PCR — zasady, zastosowanie i znaczenie kliniczne

Zakażenia pasożytami jelitowymi stanowią istotny problem zdrowia publicznego, szczególnie w populacji dzieci oraz osób z obniżoną odpornością. Tradycyjne metody diagnostyczne, takie jak mikroskopowa ocena preparatów kału, cechują się ograniczoną czułością i zależą w dużym stopniu od doświadczenia diagnosty laboratoryjnego.
Rozwój metod biologii molekularnej, w tym reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR – Polymerase Chain Reaction), umożliwił istotne zwiększenie czułości i swoistości wykrywania pasożytów jelitowych w materiale kałowym.

Zasada działania metody PCR

Metoda PCR polega na amplifikacji (powieleniu) specyficznych fragmentów DNA lub RNA patogenu obecnych w próbce biologicznej, nawet jeśli występują one w śladowych ilościach.

Proces przebiega w cyklicznych etapach:

1. Denaturacja – rozdzielenie dwuniciowego DNA pasożyta na pojedyncze nici.

2. Przyłączanie starterów (primers) – krótkie sekwencje DNA wiążą się do określonych miejsc na nici DNA pasożyta.

3. Elongacja – enzym polimeraza DNA syntetyzuje nową nić DNA, wykorzystując oryginalną nić jako matrycę.

Powtarzanie tych cykli prowadzi do wykładniczego zwiększenia liczby kopii wybranego fragmentu DNA, co umożliwia jego wykrycie nawet w przypadku bardzo małej ilości pasożyta w próbce.

Materiał do badania i przygotowanie próbki

Materiałem do badania są próbki kału, najczęściej trzy próbki pobierane w odstępach kilku dni, co zwiększa szansę wykrycia pasożytów wydalanych okresowo.
Próbki są następnie poddawane:

• ekstrakcji kwasów nukleinowych (DNA/RNA),

• oczyszczeniu i przygotowaniu do reakcji PCR,

• analizie uzyskanych produktów amplifikacji w czasie rzeczywistym (real-time PCR) lub klasycznym PCR.

Zakres wykrywanych patogenów

Dzięki PCR możliwe jest wykrycie szerokiego spektrum pasożytów jelitowych:

• Pierwotniaki: Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica, Dientamoeba fragilis, Blastocystis hominis, Cryptosporidium spp., Cyclospora cayetanensis, Cystoisospora belli

• Nicienie: Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ancylostoma spp., Necator americanus, Strongyloides stercoralis

• Tasiemce: Taenia spp., Hymenolepis nana, Hymenolepis diminuta

• Przywry: Schistosoma haematobium, Fasciola hepatica, Opisthorchis viverrini

• Mikrosporidia: Enterocytozoon spp., Encephalitozoon spp.

Zalety metody PCR w diagnostyce pasożytów jelitowych

• Wysoka czułość — wykrywa materiał genetyczny nawet przy bardzo niskim obciążeniu pasożytem.

• Wysoka swoistość — amplifikacja wyłącznie sekwencji charakterystycznych dla danego gatunku.

• Szybki czas uzyskania wyniku — zwykle w ciągu 1–3 dni roboczych od dostarczenia próbki.

• Możliwość wykrycia wielu patogenów jednocześnie — w ramach jednego panelu badania (badania wielopleksowe).

• Brak konieczności obecności całych form pasożytów (np. cyst, jaj), wystarczy obecność materiału genetycznego.

Ograniczenia metody

• Wykrycie DNA pasożyta nie zawsze oznacza aktywne zakażenie (możliwe wykrycie pozostałości martwych pasożytów po leczeniu).

• Konieczność przestrzegania procedur pobierania i transportu materiału, by uniknąć degradacji DNA.

• Brak informacji o stadium rozwojowym pasożyta (w przeciwieństwie do mikroskopii).

Znaczenie kliniczne

PCR jest obecnie złotym standardem w wykrywaniu wielu pasożytów jelitowych, zwłaszcza u pacjentów z:

• przewlekłymi biegunkami,

• bólami brzucha i utratą masy ciała,

• niedokrwistością o nieustalonej przyczynie,

• obniżoną odpornością,

• u dzieci uczęszczających do żłobków i przedszkoli.

Dzięki wysokiej skuteczności badanie PCR umożliwia szybkie postawienie rozpoznania i wdrożenie odpowiedniego leczenia.

Podsumowanie

Badanie kału metodą PCR stanowi nowoczesne, precyzyjne i skuteczne narzędzie diagnostyczne w wykrywaniu pasożytów jelitowych. W porównaniu z tradycyjnymi metodami mikroskopowymi cechuje się wyższą czułością, krótszym czasem oczekiwania na wynik i możliwością jednoczesnego wykrycia wielu patogenów, co ma istotne znaczenie w praktyce klinicznej.